赵永波;沈楠;目的通过应用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠,检测大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)比例的变化及相关细胞因子的漂移,观察脑内免疫排斥反应的发生状况。以期探讨干细胞移植治疗PD后,外周血中Treg的改变与脑内免疫排斥反应间的相关性及其在干细胞移植后免疫耐受中的作用。方法 SD大鼠随机分为正常对照组、PD组、(PD+PBS)组、(PD+BMSCs)组。正常对照组大鼠不进行任何处理,为完全空白对照;余下大鼠均通过脑内立体定向注射6-羟基多巴胺(6-hydmxydopamine,6-OHDA)建立PD大鼠模型。成功建模后第3周,(PD+PBS)组大鼠脑内定向注射PBS缓冲液;(PD+BMSCs)组大鼠脑内定向注射应用全骨髓贴壁法培养的大鼠BMSCs悬液;PD组大鼠不做任何处理。PBS缓冲液和BMSCs悬液注射2周后,各组大鼠均应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测其外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴细胞比例的变化,并运用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测外周血中白介素(IL)-4、IL-10和干扰素-γ(INF-γ)等相关细胞因子的改变。另外,通过免疫组织化学染色法观察大鼠脑内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元、离子钙接头蛋白分子-1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1,iba-1)阳性细胞、主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)分子的变化。同时,(PD+BMSCs)组大鼠采用EdU染色法监测移植后BMSCs的存活情况。结果脑内立体定向注射6-OHDA 3周后,部分大鼠腹腔注射阿扑吗啡可诱导出旋转行为,表现为向健侧旋转,呈首尾相接状,以210圈/30分钟为标准,建模成功率达65.45%,并且免疫组织化学染色显示,建模成功的PD大鼠偏侧TH阳性神经元毁损率可达90%以上。体外培养的大鼠BMSCs至P4时,细胞形态良好且均一,经流式细胞术鉴定,其纯度达95%以上。应用P4的BMSCs移植治疗PD大鼠2周后,BMSCs可在移植注射部位少量存活,但无法自我分化为多巴胺(dopamine,DA)能神经元,且(PD+BMSCs)组大鼠阿扑吗啡诱导旋转行为较PD组、(PD+PBS)组未见好转。另外,FCM示(PD+BMSCs)组大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴比例为(0.45±0.10)%,较正常对照组、PD组及(PD+PBS)组均显著减少(P<0.01)。ELISA示(PD+BMSCs)组大鼠外周血中IL-4、IL-10和INF-γ水平也较其他对照组显著降低(P<0.01)。同时,(PD+BMSCs)组大鼠脑内iba-1阳性细胞在移植处增生激活,MHC-Ⅱ类抗原分子表达上调,且二者与正常对照组、PD组及(PD+PBS)组相比均显著增加(P<0.01)。另外,进一步分析发现大鼠外周血中Treg比例与iba-1阳性细胞增加率、MHC-Ⅱ类抗原分子表达量均呈负相关(P<0.01)。结论本研究通过立体定向注射6-OHDA建立PD的大鼠模型,并给予脑内注射体外培养至P4的BMSCs移植治疗。此为基础,笔者验证了体外未经诱导分化的BMSCs移植治疗PD大鼠后无法自我分化为DA能神经元,甚至还可引起脑内免疫排斥反应,导致最终的治疗失败。另外,BMSCs移植治疗PD大鼠后外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg比例显著降低、相关细胞因子水平也明显下降,并且这些改变与移植后脑内免疫排斥反应的发生相关。
2013年12期 v.5 23-43页 [查看摘要][在线阅读][下载 5450K] [下载次数：114 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：46 ]